MONITORAÇÃO IMUNOLÓGICA PÓS-TRANSPLANTE CARDÍACO
Andriy Morgun, Natalia Shulzhenko , Maria Gerbase-DeLima
Setor de Imunogenética, Disciplina de Alergia, Imunologia Clínica e Reumatologia, Departamento de Pediatria, Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, São Paulo, SP, Brasil
Correspondência:
Profa. Maria Gerbase-DeLima
Setor de Imunogenética – UNIFESP – Escola Paulista de Medicina
e-mail:
gerbase@igen.epm.brTítulo resumido: Expressão de genes de ativação imune em transplante cardíaco
UNITERMOS
Palavras chave: Rejeição em Transplante Cardíaco, Monitoração Imunológica; RT-PCR; cDNA array
Key words: Cardiac Allograft Rejection; Immunologic Monitoring; RT-PCR, cDNA array
Resumo
A monitoração imunológica no pós-transplante cardíaco tem sido proposta com os seguintes objetivos: incremento na sensibilidade dos métodos correntemente utilizados para o diagnóstico de rejeição; descoberta de marcadores capazes de indicar ocorrência de rejeição antes do aparecimento de lesões histológicas; estabelecimento de parâmetros para individualização das doses/tipos de imunossupressores; descoberta de novos alvos para modulação in vivo da resposta imune. Neste artigo, revisamos a contribuição, em termos de respostas a estas questões, de estudos em que foi realizada avaliação de expressão de genes da resposta imune em biópsias endomiocárdicas e em sangue de receptores de transplante cardíaco.
Summary
The goals of immunological monitoring after cardiac transplantation could be summarized as follows: improvement of the sensitivity of the current methods of diagnosis of rejection; disclosure of markers that could indicate the occurrence of rejection before the appearance of histologic alterations; establishment of parameters for adjustment of immunosuppression; identification of new possible targets for immunotherapy. In this paper we review the contribution to these questions of studies concerning the expression of immune activation genes in endomyocardial biopsies and in blood of cardiac transplant recipients.
O transplante cardíaco é uma terapêutica eficaz para pacientes com insuficiência cardíaca terminal. Entretanto, a reação de rejeição continua a representar uma grave ameaça para seu sucesso, a despeito da grande evolução que vem ocorrendo em termos de drogas imunossupressoras. A rejeição aguda é a principal causa de morbidade e de mortalidade no período entre 30 dias e 12 meses pós-transplante e, juntamente com a rejeição crônica e as neoplasias, representa também uma importante causa de morte no pós-transplante tardio1.
Durante o primeiro ano pós-transplante, a incidência de rejeição aguda situa-se em torno de 40 episódios de rejeições/100 pacientes/mês2. É muito importante seu diagnóstico precoce e preciso, de maneira a orientar, com segurança, sobre a necessidade de tratamento imunossupressor suplementar.
Diagnóstico de rejeição no transplante cardíaco
O diagnóstico de rejeição aguda do transplante cardíaco repousa fundamentalmente na avaliação histopatológica de biópsias endomiocárdicas, (BEM) uma vez que as alterações funcionais decorrentes da rejeição se expressam em geral mais tardiamente. A avaliação histológica de BEM, entretanto, apresenta problemas de sensibilidade e nem sempre permite a distinção entre episódios de rejeição leves, auto-limitados, e aqueles que irão progredir para quadros mais sérios.3-9
Desta maneira, tornam-se importantes pesquisas sobre outros métodos que, isoladamente, ou em conjunto com a avaliação histológica de biópsias endomiocárdicas, possam contribuir para uma maior precisão no diagnóstico de rejeição do transplante cardíaco.
Monitoração imunológica
O reconhecimento de aloantígenos pelos linfócitos T, em conjunto com sinais co-estimulatórios apropriados, inicia uma cascata de eventos, envolvendo uma série de citocinas e de células, que culminam na reação de rejeição aguda. Com base no conhecimento dos diversos elementos que participam da resposta imune contra o enxerto, tem sido proposta a monitoração imunológica no pós-transplante com os seguintes objetivos:
Que moléculas devem ser investigadas?
Qualquer molécula que participe na ativação, desenvolvimento, regulação ou fase efetora da resposta imune é candidata a fornecer informações sobre a resposta imune do receptor contra o enxerto.
Onde e como monitorar?
A maior parte dos estudos têm utilizado fragmentos de endomiocárdio, colhidos por ocasião das biópsias rotineiramente realizadas com finalidade de diagnóstico de rejeição. Amostras de sangue, representando uma alternativa não invasiva, também têm sido também investigadas. Os métodos empregados devem apresentar boa reprodutibilidade e serem de execução relativamente rápida.
Qualquer que seja o material ou método utilizado, maiores informações são em geral obtidas quando os testes são realizados de maneira seriada, permitindo que sejam consideradas flutuações de valores em um mesmo paciente.
Os métodos de biologia molecular vêm apresentando grandes novidades nos últimos anos, oferecendo um grande potencial de utilização para o seguimento de receptores de transplantes de órgãos. Os métodos baseados em reação em cadeia catalizada pela enzima DNA polimerase em combinação com transcrição reversa (RT-PCR, de reverse transcriptase-polymerase chain reaction) são os mais utilizados, especialmente em situações em que somente pequenas quantidades de material são disponíveis para análise. No método de RT-PCR, inicialmente o RNA total ou o RNA mensageiro (mRNA) é isolado da amostra e convertido em seu DNA complementar (cDNA). A seguir, o cDNA é amplificado através PCR com primers específicos para o gene de interesse. A quantificação do cDNA pode ser realizada através do método tradicional de ensaio competitivo ou através do novo método denominado "real-time" RT-PCR. A quantidade de cDNA reflete a quantidade de mRNA o qual, por sua vez, reflete o grau de ativação do gene e também, em geral, a quantidade da proteína sintetizada.10,11
Monitoração imunológica e diagnóstico de rejeição
A pesquisa de parâmetros de ativação imune em fragmentos de biópsias endomiocárdicas, através de técnicas imuno-histoquímicas ou através da detecção de mRNA, tem sido bastante explorada, nos últimos 10 anos, como ferramenta diagnóstica de rejeição no transplante cardíaco.12-39 Os resultados obtidos em relação a algumas moléculas, como, por exemplo, IFN-g , TNF, CD40L e IL-8 apresentam muitas controvérsias, observando-se desde correlação de sua detecção com rejeição aguda, 15, 24, 27, 28, 30 até falha de sua detecção em todas as biópsias estudadas. 17, 23, 25, 26 Entretanto, em relação às moléculas efetoras de citotoxicidade mediada por células (FasL, granzima, perforina), os estudos são unânimes em detectar a expressão aumentada destas moléculas durante a rejeição. 13, 21, 31
Nosso grupo demonstrou aumento de expressão de vários genes de moléculas envolvidas na resposta imune em biópsias endomiocárdicas com rejeição histologicamente comprovada. Estes genes incluem os codantes para moléculas co-estimulatórias (CD40L, TIRC7, CD27), citocinas (IFN-g , IL-8), e moléculas efetoras de citotoxicidade mediada por células (perforina, granzima B, FasL) 33-36. É importante notar que a detecção de aumento de expressão de um gene isolado (por ex., TIRC7) ou de uma combinação de genes (por ex (perforina, granzima B, FasL) permitiu se atingir 100% de sensibilidade no diagnóstico de rejeição. O poder do teste de análise de expressão gênica em biópsias pode ainda ser apreciado considerando-se que uma alta sensibilidade é alcançada através do exame de um só fragmento de biópsia, em contraste com o exame histopatológico, que requer o exame de 3 a cinco fragmentos para produzir resultados confiáveis.
Estudos de expressão gênica em células mononucleares de amostras de sangue colhidas no momento da realização de biópsia mostrou que durante os episódios de rejeição ocorria um aumento dos níveis de mRNA TNF-a e IL-8, enquanto que havia diminuição dos níveis de mRNA de TIRC7, perforina, granzima B e IFN-g . 37 É interessante notar que todas as moléculas cujos níveis de mRNA aumentaram durante a rejeição correspondem a moléculas que são principalmente, ou exclusivamente, produzidas por monócitos/macrófagos, enquanto que aquelas cujos níveis de mRNA eram menores durante a rejeição correspondiam a produtos de linfócitos T ativados. Uma possível explicação para esta última observação é que durante a rejeição haja uma maciça migração de linfócitos T ativados da periferia para o enxerto, resultando em uma redução destas células no sangue periférico.
Os resultados obtidos até o momento parecem indicar que a utilização de marcadores no sangue periférico na monitoração imunológica pós-transplante é dificultada pela grande variabilidade individual nos níveis de mRNA, o que torna impossível o estabelecimento de pontos de corte para serem utilizados na clínica.34, 37 Além disto, os níveis de mRNA de células mononucleares do sangue parecem sofrer a influência de outros fatores além da rejeição, tais como níveis de imunossupressores e ocorrência de infecção. Acreditamos, entretanto, que a análise seriada e combinada de vários marcadores no sangue ainda possa vir a representar uma ferramenta útil na monitoração pós-transplante.
Monitoração imunológica e predição de rejeição
Com o objetivo de investigar marcadores com valor preditivo para a ocorrência de rejeição a curto prazo (15 dias), comparamos a expressão de genes em biópsias sem alterações histológicas que foram seguidas (biópsias pré-rejeição) ou não (biópsias sem rejeição) por um episódio de rejeição comprovado por biópsia em um intervalo de 7 a 15 dias. Os resultados mostraram expressão aumentada dos genes de IFN-g , TIRC7, perforina, granzima B e FasL em biópsias pré-rejeição.34-36 Ainda que outros estudos sejam necessários para avaliar a propriedade de instituição de tratamento contra a rejeição com base no aumento dos níveis de mRNA destas moléculas em biópsias, este fenômeno poderia pelo menos indicar a necessidade de uma nova biópsia em intervalo menor do que o que seria respeitado dentro do esquema rotineiro de biópsias.
Valor preditivo de rejeição a longo prazo foi descrito em relação a níveis de expressão de mRNA de bFGF (basic fibroblast growth factor) em biópsia colhida ao final da primeira semana pós-transplante.38 Dados de nosso laboratório sugeriram associação entre ausência de expressão intra-enxerto do gene da molécula co-estimulatória CD27 e a não ocorrência de rejeição aguda nos seis primeiros meses pós-transplante.39
Descoberta de possíveis alvos para modulação in vivo da resposta imune
Resultados promissores em termos de sobrevida do enxerto foram obtidos em modelos experimentais de transplantes através da utilização de anticorpos ou de moléculas solúveis capazes de bloquear a co-estimulação de linfócitos T. O sucesso de medidas semelhantes em transplantes no homem pode ser antecipado, desde que as moléculas-alvo do bloqueio estejam expressas em linfócitos T ativados, mesmo em pacientes que estejam submetidos à imunossupressão. Os estudos que realizamos envolvendo uma série de moléculas co-estimulatórias sugerem que seria interessante tentar o bloqueio de CD40L e TIRC7.34, 35 Por outro lado, não parece promissor o bloqueio de 4-1BB ou de CD70, uma vez que não detectamos nenhuma destas duas moléculas em biópsias, talvez porque sua expressão tenha sido eficientemente bloqueada pelas drogas imunossupressoras de uso corrente.
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A Tecnologia de cDNA array na monitoração imunológica
Em contraste com métodos como o RTPCR que permitem a investigação de um número relativamente pequeno de genes, a tecnologia de cDNA array oferece a possibilidade de uma análise simultânea da expressão de centenas a milhares de diferentes genes. Neste método, o RNA é inicialmente transformado (transcrição reversa) em cDNA marcado com fluorceína ou com isótopos radioativos. Este cDNA é então hibridizado com uma matriz onde estão dispostas as sondas complementares aos diversos genes sob investigação. As matrizes podem ser membranas de náilon ou lâminas de vidro ou de plástico. Após a hibridização, a matriz é lavada e escaneada para detecção de sinais de radioatividade ou de corantes fluorescentes, através de sistemas automáticos de detecção. O sinal gerado em cada ponto será proporcional à quantidade de cDNA derivado da amostra.40
O interesse desta tecnologia para a monitoração pós-transplante é muito grande porque a comparação do padrão de expressão dos genes em amostras de biópsias com e sem rejeição, por exemplo, permitiria a identificação de genes, ou conjuntos de genes, que apresentam as maiores amplitudes de variação de expressão entre as duas condições. Estes genes, incluindo genes que codificam para moléculas envolvidas na resposta imune ou não, para moléculas conhecidas ou não, seriam candidatos a marcadores de rejeição.
Até o presente, há poucos estudos em que a tecnologia de cDNA array tenha sido utilizada para explorar a resposta mune ao enxerto. Em um estudo recente, nós utilizamos esta tecnologia para investigar o nível de expressão de 268 genes da resposta imune em respostas alogênicas in vitro (cultura mista de linfócitos) e in vivo (transplante cardíaco). 41 Este estudo revelou uma série de genes cujos níveis de expressão poderiam ser úteis como marcadores de rejeição. Além disto, evidenciou que o nível de expressão de alguns genes foi maior em biópsias sem do que com rejeição, o que está de acordo com o conceito que os períodos sem rejeição não representam períodos de ausência de atividade imunológica e sim períodos em que circuitos imunológicos antagônicos à rejeição estejam atuando. A investigação das moléculas que participam destes circuitos também poderia gerar conhecimentos importantes para o desenvolvimento de novas perspectivas no campo da imunossupressão.
Considerações Finais
A monitoração imunológica de receptores de transplante cardíaco
representa uma ferramenta muito interessante, tanto no sentido de entendimento da reação
de rejeição no homem como para estabelecimento de
marcadores que possam aumentar a sensibilidade do diagnóstico histológico de rejeição.
Entretanto, há ainda peculariedades e dificuldades que devem ser consideradas, tais como:
a utilidade de cada marcador deve ser validada para cada esquema imunossupressor; a
importante variabilidade interindividual em relação aos níveis de expressão dos
diferentes genes torna difícil estabelecer limites de normalidade; a ocorrência de
infecções pode afetar os níveis dos marcadores, especialmente quando avaliados no
sangue periférico.